L’opéra prend place dans un village d’Ukraine lors de la nuit de Pentecôte. Il se déroule à deux niveaux : les farces de jeunes gens dans un village, et l’étang avec ses rusalki.
La première mention des rusalki vient assez tôt dans le premier acte, lorsque le jeune cosaque Levko raconte à son amoureuse Hanna l’histoire du vieux manoir. Il y a très longtemps, un officier cosaque vivait dans le manoir près de l’étang avec sa fille Pannotchka (« jeune fille » en ukrainien). Il était veuf, et décida de se remarier. Sa nouvelle épouse était très belle, mais elle jeta sur la jeune fille un regard qui la terrifia. Dans la nuit, Pannotchka vit un chat noir aux griffes de fer ramper vers elle, et lui sauter à la gorge. Elle le frappa avec le sabre de son père, et le chat disparut. Quand la nouvelle épouse sortit de ses appartements, deux jours plus tard, elle avait la main bandée. Pannotchka compris alors que la femme qu’avait épousée son père était une sorcière. Traitée comme une servante puis chassée de la maison, Pannotchka se jeta dans le lac et devint une rusalka. Les vieilles femmes racontent que depuis, les rusalki sortent au clair de lune sous la conduite de Pannotchka pour chanter et danser dans le jardin du vieux manoir. Un jour, Pannotchka vit sa marâtre et la jeta à l’eau – mais celle-ci se transforma elle aussi en rusalka ! Depuis, Pannotchka demande chaque nuit aux passants de l’aider à savoir laquelle des rusalki est sa belle-mère.
Mais maintenant, le manoir a été vendu et le nouveau propriétaire veut en faire une distillerie. Le second acte met en scène les facéties des jeunes gens envers le maire et sa belle-sœur. Le maire est aussi le père de Levko et s’oppose à son mariage : il aimerait bien épouser lui-même Hanna.
Au troisième acte, c’est la nuit, la lune s’est levée et Levko est seul près de l’étang. Il pense à sa bien-aimée et chante en s’accompagnant à la bandoura. La musique attire Pannotchka, qui apparaît à une fenêtre du manoir. Puis les rusalki émergent de l’étang, vêtues de blanc. Elles chantent leur vie présente et leur oubli des jeunes gens qui se sont moqués d’elles après les avoir aimées et les ont conduites à se jeter dans l’eau par désespoir amoureux. Les rusalki chantent et rendent hommage à la lune dorée, « notre mère vénérée ». Levko réalise qu’il ne rêve pas et que les rusalki sont bien présentes. Pannotchka s’adresse à lui ; Levko lui manifeste sa compassion ; et Pannotchka lui demande de l’aider à découvrir sa marâtre.
Les rusalki entament un jeu, « le corbeau ». C’est un dialogue avec un corbeau, qui menace les enfants et les arrache à leur mère. Une rusalka refuse d’être le corbeau, une autre s’avance : elle le veut bien. Lorsqu’elle dit qu’elle jettera la soupe dans les yeux des enfants, ses yeux brillent et elle est entourée d’une lumière surnaturelle. Levko la désigne : c’est la marâtre de Pannotchka. Les autres rusalki se jettent sur elle et l’entraînent dans l’eau. En récompense, Pannotchka heureuse confie à Levko un mot à remettre au maire. Ce mot, signé selon toute apparence du commissaire, le supérieur du maire, lui ordonne de faire des réparations dans le village et de procéder aux noces de Levko et Hanna. L’opéra se termine avec tout le village réuni, le maire se remémorant un passé qu’il dit glorieux, et Levko et Hanna priant pour Pannotchka.