Ils se répartissent en deux camps : les royalistes, partisans du roi d’Angleterre, d’Écosse et d’Irlande Charles 1er (qui a déjà été exécuté à la date où se place l’opéra), et les républicains qui luttent contre eux lors de la guerre civile du 17° siècle.
Du côté des royalistes, il y a Arturo Talbot et Enriquetta (Henriette de France), la veuve du roi Charles 1er et prisonnière des rebelles républicains, qui ignorent son identité.
Les républicains — les Puritains du titre — sont les plus nombreux ; l’action se passe d’ailleurs dans l’une de leurs places fortes, sur la côte sud de l’Angleterre. Lord Gualtieri Valton commande la forteresse ; sont aussi présents son frère Giorgio Valton et sa fille Elvira. Riccardo Forth est un des officiers républicains, à qui Walton a promis la main de sa fille ; un autre officier est Bruno, à qui Riccardo se confie. Il y a aussi les soldats de l’armée, les serviteurs du fort, et des villageois et villageoises.
Enfin, même s’il n’apparaît pas explicitement dans l’opéra, Olivier Cromwell y joue un rôle restreint mais essentiel, puisque c’est à lui qu’est dû l’heureux dénouement final.